RESULTADO 1: Obtención de una Base de Focos de seca y Base de datos de árboles selectos en Cádiz y Extremadura.

 

Indicador de resultado intermedio o hito:

1. Base de datos geo-referenciada estratificada en función de regiones ecológicas y del mapa de calidad del corcho
2. Base de datos seleccionada por fotointerpretación de una serie temporal de imágenes aéreas; Plano de superficie inspeccionada de alcornocales.

Indicador de resultado final

1. Selección de focos de seca por fitóftora geo-referenciados; Plano de focos de seca.
2. Preselección de árboles candidatos: Fichas y fotos descriptivas de cada árbol, coordenadas, datos y contacto del propietario /gestor.

 

 

1.1. OBTENCIÓN DE LA BASE DE DATOS “FOCOS DE SECA” EN CADIZ

 

En el inventario realizado en el año 1999 por la Red de Andaluza de Daños Biológicos, se reportó que en la provincia de Cádiz se detectaron 158 focos de seca (Carrasco, A. y cols. 2009). Esta información no se encuentra disponible, por lo que, ante la falta de un inventario de focos, se diseñó un procedimiento para la detección de focos de seca en esta provincia y se añadieron focos detectados por miembros del grupo operativo (ASAJA CADIZ). Para analizar la superficie se utilizó una superposición del Mapa Forestal de España a escala 1:50.000 (MFE50) de los alcornocales en Cádiz y el Mapa de Calidad de Corcho 2012. Este Mapa de calidad aúna las áreas de alcornocal de Andalucía con los datos de calidad del corcho obtenidos a partir de los trabajos del Plan de Calas y el Servicio del Alcornocal y el Corcho de Andalucía (SACA,) para índices de calidad media de corcho (IQ) altos (9,5-10,5) o muy altos (10,5 a 19,5). En total se evaluó una superficie aproximada de 78.000 has (Plano1).

 

Para la identificación de focos de seca dentro de esta área se utilizaron:

• Fotografías aéreas del año 1956: correspondientes al vuelo de la “Serie B” realizado durante 1956-57 por el Servicio Cartográfico del Ejército de los Estados Unidos (Army Map Service). Estas fotografías se caracterizan por tener una escala variable de 1: 33.000 – 1: 35.000.

 

•  Fotografías aéreas del año 1973: pertenecientes al vuelo fotogramétrico interministerial, en blanco y negro con escala del vuelo aproximada 1:10.000 y tamaño de pixel (GSD) 1 m.

 

• Ortofotografías del año 2019: que se corresponden al Plan Nacional de Ortofotografía Aérea (PNOA). La resolución espacial es de 0.25 m2 por píxel y se proporciona en formato digital RGB, con una resolución espectral de 8 bits por banda y en formato Enhanced Compression Wavelet (ECW). En este caso, se consideraron como las más idóneas para la identificación del arbolado.

 

Con las imágenes obtenidas (escala 1: 2.000) se analizó la dinámica temporal sufrida en el arbolado de la cubierta arbórea, su abundancia y su densidad. Básicamente, consistió en operaciones de superposición de capas para observar diferentes categorías de áreas en función de la presencia o ausencia de arbolado en cada uno de los años.

 

Como resultado, se consideraron Focos de seca aquellas áreas cuya densidad arbórea disminuyó en más de un 30% desde 1956 y con presencia de árboles afectados (Plano 2), según la escala visual de ortofotografias del protocolo del grupo CYCITEX. Cabe señalar, que en este primer trabajo solamente se hace referencia a la localización de los focos y no a las causas o factores que lo han originado. Posteriormente, sí se ha realizado un diagnóstico de algunas zonas con el análisis de muestras recogidas.

 

 

Plano 1: Superficie inspeccionada de alcornocales.

 

 

Plano 2: Localización de Focos de seca (MONTARSA

 

 

1.2. BASE DE DATOS “FOCOS DE SECA” EN EXTREMADURA

 

Técnicos del Área de Sistemas Forestales del Instituto del Corcho, la Madera y el Carbón Vegetal (ICMC), centro adscrito a Cicytex, dependiente de la Consejería de Economía, Ciencia y Agenda Digital de la Junta de Extremadura, han identificado los alcornoques que podrían ser resistentes al patógeno Phytophthora cinnamomi, causante de la enfermedad de la seca, en focos activos detectados previamente en la comunidad.

 

El primer paso de todo el proceso ha sido la elaboración de una base de datos con los focos de seca identificados en Extremadura, prestando especial atención a los focos ubicados en zonas con calidad de corcho superior a la media de la región, ya que se trata de seleccionar árboles tolerantes que presenten además buena producción y calidad de corcho.    Para verificar la ausencia de sintomatología en los alcornoques, así como la presencia de Phytophthora cinnamomi en el entorno, se recogen tambieñn muestras de suelo y raicillas de los alcornoques seleccionados.

 

 

 

RESULTADO 2: SELECCIÓN DE ARBOLES CANDIDATOS BUENOS PRODUCTORES DE CORCHO EN “FOCOS DE SECA” DE CADIZ Y EXTREMADURA.

Selección y evaluación de 30 genotipos de alcornoque en base a producción de corcho y fitóftora: 18 en Cádiz y 12 en Extremadura

 

Indicadores de resultado final:

1. Selección y estudio de árboles candidatos: de las Fichas de candidatos se han seleccionado en base a criterios de producción de corcho y morfología confirmada en campo candidatos varios candidatos: Protocolo de selección.
2. Evaluación de cada árbol seleccionado: Arboles Quercus Selección (Plano 3).

 

2.1. DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE FOTOINTERPRETACIÓN PARA LA SELECCIÓN DE CANDIDATOS

 

Una vez determinados los focos de seca, se seleccionaron los árboles potencialmente candidatos mediante foto-interpretación de las orto-fotografías. Para ello, cada uno de los focos establecidos se analizaron en base a diferentes criterios establecidos por el protocolo del grupo CYCITEX:

 

1. Tiempo de exposición: dando preferencia a aquellos focos que, aun presentando una sintomatología similar, se hubieran iniciado antes. Debido a los largos periodos de latencia de la enfermedad y para evitar seleccionar árboles con infecciones latentes, no se consideraron aquellos focos cuyos primeros síntomas se observan desde hace menos de 10 años en masas puras de alcornoque.
2. Presencia de alcornoques asintomáticos (árboles candidatos): en cada uno de los focos se buscaron pies candidatos que estuvieran en una posición central respecto a los sintomáticos y dentro del foco, evitando árboles afectados por el efecto borde.
3. Densidad de arbolado: los focos se clasificaron en función de la densidad de árboles que había entorno al árbol candidato (Baja = cuando estaba sólo en la zona; Media = junto a 1 ó 2 árboles y Alta = en un pequeño grupo). Se supone que no existen poblaciones tolerantes sino individuos.
4. Posición del árbol candidato: se valoró la situación en la que se encontraba el árbol candidato en el foco (central o en el borde).

 

A cada uno de los focos se le dio un valor en función de la siguiente escala:

 

5 = Foco sin presencia de árboles candidatos

4 = Foco con presencia de árboles candidatos y densidad alta

3 = Foco con presencia de árboles candidatos y densidad media

2 = Foco con presencia de árboles candidatos, densidad baja y posición en el borde

1 = Foco con presencia de árboles candidatos, densidad baja y posición central

 

 

Los focos que reunieron a priori las mejores condiciones para encontrar las características buscadas en un árbol candidato fueron preseleccionados. Posteriormente, algunos de los focos preseleccionados fueron visitados. Los árboles supervivientes en los focos seleccionados se marcaron como árboles candidatos (Se realiza una base de datos con las Fichas descriptivas y fotos de cada árbol, coordenadas, datos y contacto del propietario /gestor).

 

 

TOMA DE MUESTRAS DE SUELO Y RAIZ

 

Para conocer el estado real de cada uno de los focos se tomaron muestras de suelo y raíz de cada uno de los árboles candidatos y de un árbol sintomático próximo a éste. Para ello, a 1 m de distancia del tronco de cada árbol seleccionado se realizan tres hoyos de 15-20 cm de profundidad y se extraen raicillas absorbentes que presenten algún tipo de lesión característico de podredumbre radical, como necrosis y descascarillamiento. Estas raíces se envuelven con papel absorbente humedecido y se introducen en bolsas de plástico numeradas. Por otro lado, se recogen 500 g aproximadamente de suelo de los tres puntos. Las muestras se conservan en frío (nevera portátil) hasta su análisis, para evitar la pérdida de viabilidad del patógeno (Tabla 2).

 

Tabla 2. Análisis de muestras recogidas en los focos preseleccionados

 

FID	FINCA	CÓDIGO MUESTRA		RESULTADO			TIPO
4	La Almoraima	733		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
10	La Almoraima	722		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
11	La Almoraima	724		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
13	La Almoraima	730		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
16	La Almoraima	728		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI/PY. SPICULUM			Control
17	La Almoraima	2542		PYTHIUM SPICULUM			Control
20	La Almoraima	2549		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
21	La Almoraima	726		NO DETECTADO			Control
23	La Almoraima	736		NO DETECTADO			Control
29	Montes de Propios de Jerez de la Frontera	QSCA019(4165-5453)		NO DETECTADO			Control
31	Montes de Propios de Jerez de la Frontera	QSCA022(4161-5451)		NO DETECTADO			Control
34	Buenas Noches Taramal	121424		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
35	Buenas Noches Taramal	104818		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
37	El Cochino	716		NO DETECTADO			Control
39	LA TEJA	697		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
40	MURTA	698		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
41	PARCELA 3 ALCALA	706		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
42	LA ALMORAIMA	SEDA		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
43	Montes de Propios	1075		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
44	Montes de Propios	1080		NO DETECTADO			Control
45	Montes de Propios	1087		NO DETECTADO			Control
46	Montes de Propios	1091		NO DETECTADO			Control
47	Montes de Propios	1092		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI			Control
48	Montes de Propios		1095		NO DETECTADO	Control
49	Montes de Propios		1107		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	Control
50	Montes de Propios		1113		NO DETECTADO	Control
51	Montes de Propios		1114		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	Control
52	La Almoraima		CA1103		PYTHIUM SPICULUM	Control
53	La Almoraima		CA1104		PYTHIUM SPICULUM	Control
54	La Almoraima		la almoraimaFIFO		PYTHIUM SPICULUM	Control
0	La Almoraima		725		NO DETECTADO	Candidato
2	La Almoraima		732		NO DETECTADO	Candidato
3	La Almoraima		731 (2569)		NO DETECTADO	Candidato
5	La Almoraima		734		NO DETECTADO	Candidato
6	La Almoraima		735		NO DETECTADO	Candidato
7	La Almoraima		738		NO DETECTADO	Candidato
14	La Almoraima		2564		NO DETECTADO	Candidato
18	La Almoraima		2550		NO DETECTADO	Candidato
22	La Almoraima		727		NO DETECTADO	Candidato
24	Buenas Noches Taramal		20200825		NO DETECTADO	Candidato
25	M. Propios de Jerez de la Frontera		QSCA015(5456-54-57)		NO DETECTADO	Candidato
26	M. Propios de Jerez de la Frontera		QSCA016(4167-5455)		NO DETECTADO	Candidato
27	M. Propios de Jerez de la Frontera		QSCA017(4166-5454)		NO DETECTADO	Candidato
28	M.Propios de Jerez de la Frontera		QSCA018(4160-5452)		NO DETECTADO	Candidato
30	M. Propios de Jerez de la Frontera		QSCA020(4258-4163)		NO DETECTADO	Candidato
32	M. Propios de Jerez de la Frontera		QSCA021(4164-54-50)		NO DETECTADO	Candidato
36	El Cochino		715		NO DETECTADO	Candidato
38	El Cochino		717		NO DETECTADO	Candidato
1	La Almoraima		729		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI
8	La Almoraima		737		PYTHIUM SPICULUM	Candidato
9	La Almoraima		721 (2571)		PYTHIUM SPICULUM	Candidato
12	La Almoraima		723 (2570)		PYTHIUM SPICULUM	Candidato
15	La Almoraima		2541		PYTHIUM SPICULUM	Candidato
19	La Almoraima		2546		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	Candidato
33	Buenas Noches Taramal		115122		PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	Candidato

 

 

 

2.2. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE P. CINNAMOMI Y PY. SPICULUM. CONSERVACIÓN DE AISLADOS.

 

Se sembraron en condiciones asépticas en medio selectivo para el aislamiento de P.cinnamomi, 55 muestras de raíces y suelo recogidas de los árboles candidatos y testigos en los focos seleccionados,. Las colonias obtenidas se pasaron a diferentes medios de cultivo para la observación de las características morfológicas y reproductivas y para la confirmación posteriormente mediante análisis de biología molecular de P.cinnamomi. De esta forma, se ha conseguido una colección de aislados de P.cinnamomi de diversos focos de podredumbre radical de Extremadura y Cádiz para ser utilizados en los estudios posteriores de patogenicidad y para las inoculaciones o  evaluaciones del material seleccionado. Las colonias se están manteniendo en medio de cultivo PDA a 4ºC en los laboratorios de CICYTEX y de Montarsa.

 

 

Los aislados puros de P.cinnamomi obtenidos se transfirieron al grupo CYCITEX y se conservan en PDA para los ensayos posteriores (Tabla 3).

 

Tabla 3. Relación de aislados de Phytophthora cinnamomi de las muestras de Cádiz en cultivo puro

FINCA	CÓDIGO MUESTRA	RESULTADO	FECHA	CÓDIGO AISLADO
Montes de Propios	1107	PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	20190412	CA1
La Almoraima	728	PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	20200507	CA2
La Almoraima	730	PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	20200507	CA3
La Almoraima	2549	PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	20200521	CA4
Buenas Noches Taramal	121424	PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	20200528	CA5
Buenas Noches Taramal	104818	PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	20200528	CA6
Buenas Noches Taramal	115122	PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	20200528	CA7
La Teja	697	PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	20200505	CA8
La Almoraima	724	PHYTOPHTHORA CINNAMOMI	20200507	CA9

 

 

 

2.3. SELECCIÓN DE PIES CANDIDATOS

 

En el caso de los árboles candidatos, se comprobó la especie, el estado del árbol (vigor y porte), la presencia de síntomas o la ausencia de éstos en el árbol candidato (nivel de severidad) y se tomaron datos dendrométricos. se midió su diámetro a la altura del pecho, su altura total, su altura de descorche en el fuste, la longitud de descorche en las ramas y el número de éstas. Por otro lado, se realizó una valoración sobre la calidad del corcho: año de descorche, medida del calibre del corcho y porosidad.

Los arboles candidatos (Plano 3). se ordenaron teniendo en cuenta fundamentalmente criterios de resistencia a la enfermedad y el vigor y porte del árbol. Los rasgos económicamente importantes, como la rectitud o la calidad de corcho, pueden ser genéticamente independientes de la resistencia a patógenos o a factores adversos. Aunque como se ha partido de la búsqueda de candidatos en zonas de alta o muy alta calidad de corcho, se ha dado prioridad a  la resistencia.

 

 

Plano 3: Localización de árboles candidatos en Cádiz (MONTARSA)

 

Tabla 4. Valoración de árboles seleccionados como árboles plus en Cádiz

 

CÓDIGO	PROVINCIA	TM	FOCO SECA	FOCO PODREDUMBRE	DETECCION	POSICIÓN EN EL FOCO	DISMINUCIÓN DENSIDAD	DISMINUCIÓN >10 AÑOS	NIVEL DE SEVERIDAD	VALOR
QSCA022	Cadiz	Jerez de la Frontera	1	1	1	1	1	1	1	7
QSCA020	Cadiz	Jerez de la Frontera	1	1	1	1	1	1	2	8
QSCA018	Cadiz	Jimena de la Frontera	1	1	1	1	2	2	1	9
QSCA021	Cadiz	Jerez de la Frontera	1	1	1	1	1	1	3	9
QSCA024	Cadiz	Jerez de la Frontera	1	2	1	1	1	1	2	9
QSCA016	Cadiz	Jimena de la Frontera	1	2	1	1	2	1	1	9
QSCA017	Cadiz	Jimena de la Frontera	1	2	1	1	2	1	2	10
QSCA008	Cadiz	Castellar de la Frontera	1	1	1	1	1	1	5	11
QSCA011	Cadiz	Castellar de la Frontera	1	1	1	1	1	1	5	11
QSCA001	Cadiz	Castellar de la Frontera	1	1	1	1	1	1	5	11
QSCA012	Cadiz	Castellar de la Frontera	1	1	1	1	1	1	5	11
QSCA015	Cadiz	Castellar de la Frontera	1	1	1	2	2	2	2	11
QSCA023	Cadiz	Jerez de la Frontera	1	2	1	2	2	2	1	11
QSCA013	Cadiz	Castellar de la Frontera	1	2	1	1	1	2	4	12
QSCA004	Cadiz	Castellar de la Frontera	1	2	1	1	2	2	3	12
QSCA006	Cadiz	Castellar de la Frontera	1	1	1	2	1	2	4	12
QSCA025	Cadiz	Jerez de la Frontera	1	2	1	1	2	2	3	12
QSCA009	Cadiz	Castellar de la Frontera	1	1	1	2	2	2	5	14

 

 

 

2.4. PROTOCOLO DE INOCULACIÓN EN PLANTA SOMÁTICA

Para la evaluación de la resistencia/tolerancia de los clones que se obtengan del cultivo in vitro se han desarrollado diversas técnicas de inoculación con el fin de obtener un protocolo práctico, fiable y reproducible para cribar el material obtenido y seleccionar los individuos más tolerantes. Se inocularán plántulas obtenidas en cultivo in vitro en varios estados de desarrollo. Los trabajos serán comprobados en los genotipos seleccionados en el Departamento de Patología del CICYTEX y en el laboratorio de Montarsa.

 

 

GUÍA PROTOCOLO INOCULACION.

 

 

2.5. ESTUDIO DE VARIABILIDAD PATOGÉNICA EN PHYTOPHTHORA CINNAMOMI

Se ha realizado un estudio de patogenicidad de aislados (10) obtenidos en el proyecto sobre plantones de alcornoque en cámara de cultivo y condiciones controladas. Paralelamente para el estudio de variabilidad genética, se ha extraído DNA a partir del micelio de aislados (35) del patógeno en alcornocales de Extremadura y Cádiz. La cantidad de DNA por extracto se ha cuantificado mediante un Nanodrop. Para verificar la calidad del material genético se llevaron a cabo reacciones PCR y una posterior electroforesis. Se está purificando el material obtenido que será secuenciado.

 

 

Foto 1. Colección de aislados de Phytophthora cinnamomi obtenidos en el proyecto. Los aislados proceden de Cáceres, Badajoz y Cádiz y se conservan a 10C en placa con medio de cultivo y en viales con agua.

 

 

Foto 2. Ensayo de patogenicidad sobre alcornoque de los diferentes aislados de Phytophthora cinnamomi obtenidos en el proyecto.

 

 

 

Resultado 3: Clonación de genotipos seleccionados mediante embriogénesis somática.

 

Indicador de resultado intermedio o hito:

Obtención de líneas embriogénicas de cada árbol: Tabla 1.

 

 

Tabla 1. Líneas embriogénicas de alcornoques Quercus Selección a 15.09.21

 

 

 

 

Indicador de resultado final:

Obtención de 100 embriones por genotipo. Tabla 2.

Obtención de 40 plantas por genotipo.

Transferencia del Protocolo de micropropagación:  Guía para la micropropagación de alcornoque.

 

Tabla 2. Obtención de plantas in vitro de alcornoques Quercus Selección

 

 

Fotos tarrinas genotipos de Extremadura (1) y Cádiz (2).

 

 

TRANSFERENCIA PROTOCOLO MICROPROPAGACIÓN

Los árboles seleccionados han sido clonados por el IMIDRA mediante embriogénesis somática según protocolo propio: Toribio et al (2005) Jain SM, Gupta PK (eds) Protocol for somatic embryogenesis in woody plants. Forestry sciences, vol 77: 445-457

 

PROTOCOLO DE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE ALCORNOQUE ADULTO (IMIDRA)

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de explantos iniciales

De cada árbol se cortan tres ramas de al menos tres posiciones diferentes, según la accesibilidad. El diámetro máximo de corte debe ser de unos 4 cm. Se eliminan todas las hojas y ramillas. Se corta cada rama en segmentos de 15-20 cm de largo, y entre 4 y 1 cm de diámetro, hasta tener unos 20 segmentos por árbol. En el laboratorio, se lavan y sumergen en solución fungicida durante 10 minutos. Se escurren e insertan en bandejas con perlita húmeda y se pasan a cámara de alta humedad (80-90 %HR) para su brotación. Durante la brotación se trataron las estacas con un rociado semanal de fungicida.

Introducción in vitro

De los brotes epicórmicos formados se recogen hojas de tamaño no superior a 1,5 cm. En cabina de flujo laminar, se esterilizan con etanol (70%) durante 30 s y a continuación con lejía comercial diluida al 10% con unas gotas de Tween® 20 durante 10 min. Posteriormente se enjuaga tres veces con agua estéril. De cada árbol se introducen en cultivo in vitro, como explantos iniciales, aproximadamente 150 hojas. Se cultivan en placas Petri de 60 mm de diámetro con 10 ml de medio de preacondicionamiento, a razón de tres hojas por placa, disponiéndolas con el envés en contacto con el medio. Éste se compone de los macronutrientes de Gamborg (1966, PRL-4-C) diluidos a la mitad, micronutrientes, vitaminas y Fe-EDTA de Murashige y Skoog (1962), 10 gl-1 de sacarosa y 6 gl-1 de agar (Plantagar S1000; B&V). Las placas se sellan con Parafilm y se mantienen 7 días en oscuridad a 25±2 °C. Todos los medios de cultivo se ajustaron a pH 5,75 antes de añadir el agar, y se esterilizaron en autoclave a 121 °C, 30 min.

Inducción de embriogénesis somática

En la fase primera, los explantos se cultivan en medio con los macronutrientes de Schenk and Hildebrandt (1972), micronutrientes, vitaminas y FeEDTA de Murashige and Skoog (1962), 30 gl-1 de sacarosa y 6 gl-1 de agar (Plantagar S1000; B&V), suplementado con 50 µM de ácido 1-naftalenacético (ANA) y 10 µM de 6- bencilaminopurina (BAP). Los cultivos se mantienen en cámara de cultivo a 25±2 °C y en oscuridad durante 30 días.

En la fase segunda, se mantienen los cultivos en el mismo medio, pero suplementado con 0,5 µM de ANA y 0,5 µM de BAP, en cámara de cultivo a 25±2 °C y fotoperiodo de 16h de luz (tubos fluorescentes de SYLVANA GRO-LUX y PHILIPS coolwhite, 120-180 µmol m-2 seg-1) durante 30 días.

En la tercera fase o de manifestación de ña embriogénesis se cultivan en el mismo medio, pero sin reguladores de crecimiento, y en las mismas condiciones ambientales durante 30 días.

 

Fase de proliferación recurrente

Los embriones y masas embriogénicas obtenidas a partir de las hojas tienen la capacidad de seguir proliferando. La proliferación de cada línea embriogénica se lleva a cabo en potitos de 100 ml de capacidad (SIGMA, V8630) con el mismo medio de cultivo SH sin reguladores de la fase de manifestación, y en las mismas condiciones ambientales. El subcultivo de las masas de embriones se realiza cada dos a cuatro semanas según su tendencia a diferenciar.

Maduración de los embriones somáticos

En cada subcultivo de las líneas embriogénicas, se seleccionan embriones maduros caracterizados por el desarrollo apropiado del eje y cotiledones grandes y opacos. Estos embriones pasan a frío y si están inmaduros (<1cm o translúcidos) previamente a un medio SH con 5g/l de carbón activo durante un mes.

Estratificación

Los embriones aislados se pasan en el mismo medio de cultivo de maduración a cámara frigorífica a 4°C, en oscuridad, durante 2 meses.

Germinación

Los embriones somáticos se colocan individualmente en recipientes ECO2 BOX green filter (DUCHEFA, E1654) con 250 ml del mismo medio SH de la fase de proliferación, pero suplementado con 0,11 µM de BAP y 0,25 µM de ácido 3-indolbutírico (AIB), y se mantiene a 25±2 ° C y fotoperiodo de 16h de luz hasta su germinación completa, esto es, emisión de raíz y tallo.

Aclimatación

Los embriones que desarrollan una raíz y un tallo de más de más de 3 cm, se transfieren a contenedor forestal con un sustrato compuesto en un 40% por turba (Turba Kekkilä 50:50), un 40% de fibra de coco (Coco Peat ) y un 20% de perlita expandida (A13), con el añadido de 3 gl-1 de abono de liberación lenta (Scotts OsmocotePro 18:9:10).  Se mantiene en cámara de aclimatación, en cajas tapadas con film con alta humedad (90% HR) a 25±2 °C y fotoperiodo de 16 horas que se va perforando para ir reduciendo la humedad progresivamente hasta su apertura total.

PROTOCOLO DE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE ALCORNOQUE ADULTO

 

 

 

 

RESULTADO 4: Sistema de detección precoz y un protocolo de evaluación de resistencia a fitóftora en planta somática.

 

Indicador de resultado final:

Protocolo y comprobación de la viabilidad de un sistema de detección precoz

 

 

4.1. EVALUACIÓN IN VITRO DE CLONES DE QUERCUS SUBER SELECCIONADOS POR SU TOLERANCIA A PHYTOPTHORA CINNAMOMI MEDIANTE CULTIVOS DUALES

 

Una vez seleccionados los árboles adultos y obtenidas las líneas embriogénicas se ha probado un sistema de evaluación previa de tolerancia mediante un ensayo dual con embriones y el micelio de la fitótora.

Se probó con embriones de 8 alcornoques: 4 escape en zonas de seca y 4 control.  Como la infección de este oomiceto se produce por la raíz, favorecido por la atracción química de exudados, se germinaron y usaron las raíces de embriones somáticos en un cultivo dual con el micelio de P. cinnamomi midiendo diariamente durante 10días, el crecimiento medio del micelio y el avance de la necrosis en la raíz a las 24 y 48horas de alcanzarla.

Como resultado, se observó una clara atracción del micelio por la raíz con valores de crecimiento significativamente diferentes entre genotipos y respecto al control o árbol de la misma población no sometido al oomiceto.  La correlación entre el avance de la necrosis en la raíz y la tolerancia del individuo permitirá establecer un sistema de evaluación precoz  si coincide con los resultados obtenidos con las plantas de los mismos genotipos en una evaluación clásica.

 

4.2.  ENSAYO PATOGENICIDAD EN PLANTULA SOMÁTICA.

Se usaron dos aislados de P. cinnamomi, uno procedente de un alcornoque sintomático del Parque de los Alcornocales (Cádiz) (1107) y otro de castaño de la Sierra de Aracena (Huelva) (1304) para las inoculaciones. En este caso se partió de plántulas enraizadas in vitro de alcornoques. Se toman 6 plántulas de cada genotipo y se colocan en tubos de ensayo, 3 plántulas con 15 ml de la suspensión de zoosporas, y otras 3 con 15ml de agua, para cada uno de los aislados y se pusieron en cámara con fotoperiodo de 10h luz y 14h de oscuridad a 22ºC. El ensayo se finalizó a los 28 días de la inoculación, cuando los testigos sin inocular comenzaban a mostrar síntomas de clorosis o decaimiento. Los resultados muestran que existen diferencias significativas entre los genotipos.  El análisis detecta genotipos más tolerantes al patógeno que el genotipo control, por lo que la prueba de inoculación realizada podría ser otra forma de evaluación previa.

 

4.3.  EVALUACIÓN DE RESISTENCIA A FITÓFTORA EN PLANTA SOMÁTICA

Todos los ensayos previos realizados para evaluar precozmente a resistencia deben ser confirmados por el sistema tradicional de infección de la planta en invernadero. Esta actividad aún no se ha finalizado y se justifica porque deben realizarse cuando existan al menos 20 plantas clonales de cada genotipo seleccionado y con una edad mínima de 1 savia o año, lo que impide se pueda terminar en el plazo del proyecto. Sin embargo, se han realizado pruebas con planta somática del IMIDRA para poner a punto el protocolo.

 

 

Foto 1. Planta clonal recién aclimatada

 

 

Foto 2. Ensayos en cámara con planta de 1 savia

 

 

 

 

RESULTADO 5: Establecimiento de bancos clonales en Madrid, Extremadura y Cádiz de las variedades seleccionadas.

 

Indicador de resultado final:

Se prevé el establecimiento de 3 Bancos clonales El Encín (Madrid), CICYTEX (Badajoz) y en La Almoraima (Cádiz).

 

Los 3 centros seleccionan parcelas idóneas para utilizar como bancos clonales en las 3 ubicaciones (Extremadura, Cádiz y Madrid). El establecimiento también queda pendiente a la fecha justificado por no disponer de la toda la planta a establecer con al menos 1 savia. Sólo Almoraima tiene gasto en esta actividad y ha dejado preparado la parcela dedicada al Banco clonal a falta de incluir la planta. IMIDRA tiene preparada ya una parcela al lado de la que dispone en La Finca de El Encín. Alcalá de Henares, y CICYTEX también prepara una parcela para conservar los genotipos clonados.

 

 

 

Foto: 1. Banco clonal de El Encín con alcornoques plus, 2 Parcela 3 en la Almoraima preparada para banco clonal, 3. Parcela preparada para banco clonal (cuadro rojo) en El Encín a continuación del ya existente (cuadro verde).

 

 

 

 

RESULTADO 6: Transferencia y desarrollo de protocolo de producción in vitro a escala comercial. IMIDRA – Viveros La Veguilla.

 

Indicador de resultado final:

Producción de las variedades seleccionadas

Guía protocolo micropropagación

Seminario divulgación IMIDRA

 

Los genotipos se multiplicarán según protocolo comercial por micropropagación axilar. La Veguilla tiene en producción plantas de varios genotipos y se realizan pruebas de adaptación a sistemas de aclimatación ex vitro. En estos procesos, la Fundación Promiva realización la micropropagación in vitro del material vegetal.

 

 

Figura 1: Propagación clonal a gran escala en vivero de alcornoque selecto Quercus Selección

A. Cultivos de brotes axilares de alcornoque en medio de multiplicación con sales GD y suplementado con BAP (0,2 mg/L). Los brotes han sido obtenidos a partir un embrión somático germinado inducido en hojas de árboles de alcornoque seleccionados.

B. Macollas de brotes de alcornoque en crecimiento con desarrollo espontáneo de raíz.

C. Cultivos de brotes de alcornoque en medio de elongación, medio con sales GD suplementado con BAP (0,1 mg/L).

D. Cultivos de alcornoque en medio de inducción de raíz, consistente en medio 1/3 GD suplementado con AIB (25 mg/L).

E. Microbrotes de alcornoque en medio de expresión de raíz, consistente en medio GD suplementado con carbón activo (4 mg/L).

F. Microbrotes de alcornoque enraizados tras 6 semanas en medio de expresión de raíz.

G. Pinchado de los microbrotes enraizados en bandejas de fibra de coco para su aclimatación.

H. Sistema de aclimatación en minitunel con 85% de humedad relativa.

I. Bandejas de brotes de alcornoque en aclimatación dentro del minitunel.

J. Sistema de aclimatación en cajas de poli spam con cubierta de policarbonato.

K. Microbrotes de alcornoque enraizados y pinchados en paperpots aclimatando en cajas de poli spam.

L. Microbrote de alcornoque tras 2 semanas de aclimatación.

M. Microbrote de alcornoque tras 4 semanas de aclimatación.

 

6.2. Guía protocolo micropropagación

Se describe el protocolo de micropropagación por embriogénesis somática y axilar empleado por el grupo del IMIDRA y a adaptar por La Veguilla y Fundación Promiva:

 

1. Los brotes obtenidos a partir de un embrión somático germinado de alcornoque se mantienen en proliferación mediante dos ciclos de 30 días cada uno, empleando para ello dos medios de cultivo con sales GD (Gresshoff y Doy, 1972), suplementados con BAP (benciladenino purina) como regulador de crecimiento con dos concentraciones diferentes, GD1 o medio de multiplicación  (0,2 mg/L BAP) y GD2 o medio de elongación (0,1 mg/L BAP), además el medio está suplementado con  30 g/L de sacarosa y 5,5 g/L de Plantagar, con un fotoperiodo de 12 horas luz y 12 horas oscuridad y 23 °C.
2. Tras el periodo de elongación los brotes de más de 2 cm se cortan y se introducen en medio de inducción de raíz, GDR1, consistente en medio GD con los macronutrientes reducidos a 1/3 y suplementado con 25 mg/L de IBA (ácido indolbutírico), 30 g/L de sacarosa y 6 g/L de Plantagar, donde permanecerán durante 48 h para inducir la formación de raíz.
3. Tras las 48 h los brotes son transferidos a medio GDR-2 o medio de enraizamiento, consistente en medio GD suplementado con 4 g/L de carbón activo, sacarosa 30g/L y agar 6 g/L de Plantagar. En el medio de enraizamiento permanecen entre 4-6 semanas hasta que hay crecimiento activo y se puedan aclimatar a condiciones ex vitro.

 

 

6.3. Seminario divulgación IMIDRA- La Veguilla

 

La Veguilla (Dra. Silvia Valladares) y el IMIDRA (Dra. Inmaculada Hernández y Dra. Mar Ruiz-Galea) imparten en un seminario de 8horas del 30 de noviembre al 3 de diciembre de 2020, titulado: “Nuevas técnicas de micropropagación de encina y alcornoque en vivero”, organizado por el IMIDRA. El curso inicialmente programado presencial para12 alumnos se realiza online. El IMIDRA describe las ventajas y protocolos de las técnicas de micropropagación por embriogénesis somática y por yemas axilares y la Veguilla cómo se está ya realizando este tipo de propagación en varios cultivos a nivel comercial, reportando tanto beneficios sanitarios, económicos como sociales.

 

 

 

 

 

 

RESULTADO 7: Establecimiento de plantaciones en parcelas de Cádiz.

 

Indicador de resultado final

Establecimiento en la Almoraima de parcelas ensayo

 

Se comienza a mediados del año 2020 a buscar parcelas idóneas para ser usadas como parcelas de ensayo. La Almoraima que es el único miembro que tiene asignados gastos en esta actividad, comienza los trabajos: desbroce de la parcela, plantación de Quercus suber con progenie de alcornoques selectos de un ensayo de procedencias, riego y protectores completos, teniendo en cuenta y preparando también los huecos para la plantación posterior con los ejemplares obtenidos en el proyecto, hasta completar las 1600 plantas previstas.

 

 

Foto: 1 Preparación de parcelas, 2. Distribución de materiales, 3. Plantación parcela1 de alcornoques, 4. Plantación parcela 2 de alcornoques. 

 

 

 

RESULTADO 8: Divulgación.

Indicador de resultado final:

Jornada de resultados presencial 17 de junio de 2021.

Webinar 30 junio 2021.

 

8.1. JORNADA DE CAMPO

Tras haber sido pospuesta varias veces por las restricciones del COVID-19, se realizó el 17 de junio de 2021, la jornada presencial con varios propietarios de monte alcornocal. Antes de la visita a las plantaciones de La Almoraima, se realizó una reunión donde propietarios y técnicos forestales mostraron su interés y explicaron sus problemas y necesidades, respecto al problema de la seca y el corcho. La reunión tuvo lugar desde las 10h. en la sala auditorio del Hotel Convento de La Almoraima con la participación de su Director D. Emilio Romero, D. Ignacio Cáliz y D. Thomas C.Vrtis (ASAJA), D. Oscar Perula y D. M.Mar Ruiz-Galea e Inmaculada Hernández (IMIDRA).

Durante la jornada presencial se presentó además a los asistentes la finalidad con la que se constituyó el Grupo Operativo Quercus Selección, la metodología de trabajo que se llevó a cabo para el desarrollo de todo el proceso de estudio y análisis, así como los resultados que se iban derivando de este. Tras la fase informativa de la jornada, se llevó a cabo la visita a alguno de los árboles seleccionados dentro del proyecto y una visita a las plantaciones realizadas en La Almoraima.

 

 

Fotos de la reunión en la sala Hotel Convento de La Almoraima.

 

 

Fotos de la visita a las parcelas establecidas de La Almoraima

 

 

 

 

WEBINAR

Reunión disponible en https://www.youtube.com/watch?v=6k1NX1vP0TE

 

El 30 de junio de 2021, tuvo lugar la Webinar destinada a divulgar los resultados del proyecto a agentes y propietarios vinculados al sector corchero y forestal, así como extensiva a todos los asociados de ASAJA Cádiz, colegios, profesionales del sector forestal, y otros… contándose para su realización con la empresa Agrifood.

En esta jornada se presentaron por cada uno de los participantes, las actividades realizadas en este proyecto de innovación (AEI-Agri), financiado por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (MAPA) y en un 80% por el Fondo Europeo Agrario de Desarrollo Rural (FEADER), a través de la convocatoria de proyectos a ejecutar por grupos operativos, dentro del Programa Nacional de Desarrollo Rural 2014-2020, del año 2019.

 

 

 

https://www.asajacadiz.org/2021/07/09/el-grupo-operativo-quercus-seleccion-presenta-los-resultados-finales-del-proyecto/

La bienvenida de la jornada, que contó con más de 160 inscritos, corrió a cargo de Pedro Gallardo, presidente de ASAJA Cádiz, quien animó a continuar buscando soluciones y herramientas para seguir contando con este patrimonio y biodiversidad que tanto se demanda desde Europa. Posteriormente, Pablo Rincón, director de proyectos de ASAJA Nacional, inauguró la jornada comentando que “es muy importante desarrollar grupos operativos como éste para desarrollar nuestras dehesas y nuestro campo. Toda la problemática detectada en este proyecto, a la que se ha intentado dar solución con variedades resistentes a la enfermedad, ha sido todo un éxito y una experiencia muy enriquecedora”.

Posteriormente, Óscar Pérula, realizó una presentación del Grupo Operativo QUERCUS SELECCIÓN, donde indicó que el proyecto se crea en 2019 para contribuir en la búsqueda de una solución al problema de la pérdida de masa de alcornoque por la seca. “La iniciativa surge en la finca La Almoraima, que sufría una pérdida del 41% de corcho entre 1989 y 2019 a causa de la enfermedad. Tras visitar el Centro de la Mayora y varias reuniones, se descubre la posibilidad de clonar los alcornoques mediante embriogénesis somática, lo que da lugar a la constitución del grupo operativo en 2018, afirmó Pérula.

Tras su intervención, Enrique Cardillo de CICYTEX, habló sobre la selección de focos de Seca y de alcornoques tolerantes: “Se trata de encontrar en la naturaleza árboles capaces de tener un mejor comportamiento al ataque de la enfermedad, pero también en la producción de corcho. Para encontrar la resistencia natural partimos de lo que se conoce como el triángulo de la enfermedad, y a partir de ahí elaboramos unos criterios de selección fitopatológicos, técnicos y geográficos para detectar los árboles”.

Arantxa Ávila, de MONTARSA, expuso los resultados de la recogida y el análisis de las muestras del grupo operativo. Según indicó, en cada foco se recogieron dos muestras, una del árbol candidato y otra del árbol con síntomas de la enfermedad. Para conseguir las muestras de raíces y suelo, se recogieren dos puntos distantes de cada árbol, a 1 metro de distancia del tronco.

A continuación, Thomas de C. Vrtis de ASAJA Cádiz, habló sobre los focos de Seca y los árboles escape en Cádiz: “Se querían buscar fincas privadas de alcornocal, que estuvieran en el Parque de los Alcornocales y que tuvieran focos de seca. Por ello, en la provincia de Cádiz se escogieron fincas privadas asociadas a ASAJA Cádiz junto con La Almoraima ya que fue precursor de este proyecto, además de ser una finca con gran extensión y severos problemas de seca”.

A continuación, Inmaculada Hernández de IMIDRA, expuso la propagación in vitro de alcornoques seleccionados. “La embriogénesis somática permite clonar árboles adultos en los que se observan las características de interés. El crecimiento inicial de las plantas de origen cigótico es más vigoroso que el de las de origen somático.A medio plazo las plantas somáticas tienen un crecimiento similar al de las procedentes de bellota”, comentó Hernández.

Silvia Valladares de Viveros La Veguilla, habló sobre las ventajas del uso de la propagación in vitro a nivel comercial: “se emplea un número reducido de material de partida y se consigue una producción masiva de plantas, es una buena alternativa para especies que son difíciles de propagar por métodos convencionales, grandes cantidades de plantas pueden ser almacenadas, se pueden tener producciones homogéneas en cualquier época del año, se obtienen plantas libres de enfermedades y se consigue incrementar el número de variedades disponibles en el mercado con características mejoradas”.

Víctor M. Márquez, encargado forestal de La Almoraima, dedicó su presentación a las plantaciones y los bancos clonales de los alcornoques plus obtenidos en el proyecto, “para el banco clonal seleccionamos la parcela valorando algunos condicionantes como el agua y un suelo potencial óptimo para el alcornoque. Decidimos elegir una parcela de unas 5 ha. De suelo arenoso con ligera cobertura de matorral”, comentó Márquez.

Para finalizar,M. Mar Ruiz-Galea del IMIDRA, habló sobre los avances y las oportunidades de QUERCUS SELECCIÓN: “Creemos que con este proyecto hemos logrado avances como un sistema probado con eficacia de detección de focos de seca y árboles candidatos tolerantes a fitóftora en monte alcornocal y se ha conservado su genética usando la micropropagación vegetativa. A partir de aquí, tendremos la oportunidad de satisfacer la demanda de planta para repoblar con alcornoques plus”.

 

 

 

Capturas de pantalla de la Webinar realizada por el GO Quercus Selección el 30 de junio 2021.